Hyungbae Kwonラボの長濱健一郎さん(@k_hammer_1001)ゲスト回。初期研修から基礎研究に進んだ経緯、狩野研でのスライスパッチャー生活、Hyungbae Kwonラボの現在の方向性、最近のST Cal-Light論文（光受容とCa2+活動による細胞の遺伝学的ラベリング手法のアップデート版）について伺いました
Show Notes:
- 長濱さん
- 最近のST-Cal Light論文
- ２光子イメージング＋Stimulationでの再現論文、例えばコレ
- IEGによるラベリング等のレビュー by 川島さん
- 光とCaのアンドゲートロジックによるラベリングその１Cal-Light from Kwonラボ
- その２ FLARE from Alice Tingラボ
- Hyungbae KwonラボHP
- 狩野ラボHP
- 放射線医学研究所の八幡先生 ：収録で”ほういがく”研究所といってしまいましたが、正しくは、放射線医学研究所でした汗。by 長濱さん
- 日本医科大学の薬理学教室 （教室の独自HP: 日本医科大学薬理学 (umin.ac.jp)）
- 小林克典先生
- 高橋智幸先生
- ScienceのLTD論文
- ムーミンプー
- STDPの仕事@Neuron
- ノックアウトマウス論文の表現形解析の手伝いの仕事→当時僕がやったこと自体で論文として形に残っているものはないと思うんですが、僕のポスター発表の抄録（日本医科大学医学会雑誌第6巻第4号 (jst.go.jp)）があったので、貼っておきます。by 長濱さん
- 大久保善朗先生インタビュー
- 舘野先生
- 北沢さん回
- 奥山さん回
- 国立国際医療センター
- 青雲高校
- 青雲をよく表している動画があったので、貼っておきます by 長濱さん
- 新潟大学の脳研究所
- 新潟神経夏季セミナー
- 西澤正豊先生
- 理研CBSの林朗子さん
- 副チームリーダーの堤新一郎さん
- 医科研の真鍋先生
- 喜多村先生
- 新潟大学の崎村先生
- 松山さん＠狩野研メンバー
- 渡辺先生
- 上阪さん
- この論文＝狩野研時代のSetd1a論文（注：収録時にはmentionできなかったのですが、ChIP-seqの実験・解析、RNA-seqの解析では東大薬・分子生物学・後藤研にいらした岸先生（岸 雄介 (Yusuke Kishi) – マイポータル – researchmap）に大変お世話になりました。あと、ChR2-tdTomato→ChR2-mOrangeでした。by 長濱さん）
- 佐郡さん
- 上阪さんのretrograde semaphorinのScience論文
- BDNF
- 三國さんのArc（追記：三國さんは安田さんの回に出てきたSLENDR法を西山さんと開発した三國さん（HOME – Mikuni Lab | BRI Niigata Univ (niigata-u.ac.jp)）です。by 長濱さん）
- 奥野先生と尾藤先生の仕事
- 女子医大の宮田麻理子先生
- 中山さん
- のNeuron論文
- ASDで小脳、レビュー
- 統合失調症で小脳
- 酒井浩旭さん
- Electroporationで入れている論文
- Frame shiftの起こっているマウス： Setd1a論文で使われていた、ヒト患者のde novo LoFを模したマウス
- 狩野先生と笠井先生の革新脳
- 笠井清登先生
- ニューロランチ：東大医学部の神経系のラボが集まって、金曜日の昼飯時に行う背筋も凍りつくような名物セミナー
- NNに出ていたマイクロRNAをノックダウンしてフィアコンして…の論文→2020年と言ってしまっていたのですが、大学院に入学した年だったので、正しくは2015年9月でした汗。記録を辿ったら、この論文（GABAergic mechanisms regulated by miR-33 encode state-dependent fear | Nature Neuroscience）を読んでました。by 長濱さん
- 2016年のSingh et al.,論文
- Singhラボ
- による最近のNature論文
- プレコックス感に関するレビュー
- 2014年の高田さんの論文
- 高田ラボ
- Maria Karayiorgou
- Joseph Gogos
- 安田さん回 （訂正：キネシンではなく、正しくは”アクチンをくっつけたATPase”）
- リキッドジャンクションポテンシャル 生理研のパッチクランプ方資料の補足5(PDF注意)
- 橋本谷先生
- 同志社の坂場先生
- 菅谷佑樹先生
- 饗場篤先生
- CompetitorのSetd1a論文
- 22q11.2 deletionのマウス論文
- 向井淳さん
- iTango論文
- 稲垣さん
- David Anderson
- のところで作ったTango
- Alice Tingラボ
- Neuro2019の三國さん主催シンポジウム：4S07m 神経科学研究における新しい方法群 – ナノからマクロのレベルまで
- 生理研のシナプス研究会→2019年当時のHPがまだ残っていたので貼っておきます by 長濱さん
- オーフスの米原さんラボ（遺伝研に移行中）
- ボルチモアの治安(犯罪地図)
- Inner Harbor
- 二輪車でウィリー走行する集団
- NRアカウントに送ったSSNに関するリプライ
- Jung Ho Hyun
- Human Frontier Science Program
- Gordon Conference Optogenetics 2018
- Bernardo Sabatini
- Uncageの仕事
- bioRxivに上がっているOxytocinのiTango
- 中島さんの回
- Froemkeラボ
- Dongmin Leeラボ（注：”Nat. Biotechnol.のCal-Light論文でvalidationを全部行った”と行ってしまったのですが、正しいcontributionはCal-Lightの設計・in vitroのvalidsation→Dongmin、in vivoのvalidation→Jung Hoでした。by 長濱さん）
- Kanghoon Jung
- CRY2を使ったオプトジェネティックツールの例 （注：C“1”BNといってしまってましたが、C“I”BNでした…by 長濱さん）
- Nature GroupのAnonymous投稿, Double Blind Review
- Guopingラボ
- Guopingが使った例
- Josh Gordonラボ
- Josh Gordonが使った例
- 理研の村山さん
- Matthew Larkumラボ
- Matthew LarkumがCAMPARIと比較したFrontier論文
- Tina Kim
- FLiCRE（フリッカー）論文
- ボイデン
- エミリアーニ
- SoCoChR論文
- KA2：カイニン酸受容体２のN末端、150アミノ酸からなる細胞体局在ドメイン（SoCoChR論文で使用）
- 医科歯科の磯村先生
- 最初のCoChR論文（Klapoetke論文）
- Yizarラボ
- StCoChR論文
- についてのOferと萩原の見解
- 井上さん回
- LiqunのところのTRAP その２
- Eric Schreiter
- CAMPARI
- CAMPARI2
- rsCAMPARI
- Kv2.1：電位依存性カリウムチャネル2.1のC末65アミノ酸からなる細胞体局在ドメイン。この論文
- G over R：GFP発現細胞/RFP発現細胞のこと
- Akira Sawaラボ
- 利根川ラボCA1論文、４Hz
- DG論文、20 Hz
- OG Cal Light：細胞体にターゲティングしていない、昔の世代のCal-Lightのこと
- Paul Worleyラボ
- Seung-Eon Rohさん
- Rui Costa＠コロンビア→Allen
- NeuroRadioのJC回
- Harveryの論文
- Photoactivatable Cre 例えばコレ
- Voltageイメージングの視野：360*180 um2@500 Hz, 大体70細胞
- マイクロブルワリーがたくさん（どこもすっごくいいですが、特にUnionとかGuilfordとかはよく行きます。あと、Nepenthe（Nepenthe Brewing Co. | Baltimore, MD）とかThe Brewer’s Art (Brewpub and Restaurant | www.thebrewersart.com | Baltimore)などもお勧めです by 長濱）
活動依存な遺伝学的ラベリング手法のまとめ by 長濱さん：
- Immediate early gene-based labeling→temporal resolutionがpoor
- IEGs: c-fos, Arc, Egr1, Npas4…e.t.c.
cFos-tTA: Reijmers et al., Science 2007: Xu et al., Nature 2012
- TRAP & TRAP2: Guenthner et al., Neuron 2013 (Miyamichiさんのやつ). Allen et al., Science 2017. iCreERT2を組み合わせて、4-OHT-inducibleに改変。Nativeなfosのシーケンスを壊さないようにinsertしている。
TRAP: Guenthner et al., Neuron 2013
TRAP2: Allen et al., Science 2017 - CANE: Capturing Activated Neuronal Ensembles: Sakurai K et al., Neuron 2016 Capturing and Manipulating Activated Neuronal Ensembles with CANE Delineates a Hypothalamic Social-Fear Circuit
from Fan Wang lab @MIT. 筑波睡眠研のKatsuyasu Sakuraiさんのお仕事。Activity-dependentにdsTVAを発現するマウスにEnvAを持つPseudotyped ravies viruses (RVs) or lentiviruses (LVs)を補充。ウイルスゆえ、10日以上発現を待つ必要がある。
- E-SARE: enhanced version of synaptic activity-responsive element (Kawashima et al., Nat. Methods, 2013). Arc-mini promoterの前にSAREを重ねて発現。
- RAM: Robust Activity Marking: Sorensen et al., eLife 2016 A robust activity marking system for exploring active neuronal ensembles
from Yingxi Lin lab. AP-1 site (from FOS/JUN family of DNA binding protein) + binding morif of Npas4の組み合わせ。Human Fos-mini promoterの上流に4つtandemに挿入。E-SAREと比較。Labelingのみ。
- CaMPARI; Schreiter lab @Janelia →labelingだけで、manipulationができない
- Ver.1 (Fosque et al., Science 2015): Photoconvertible fluorescent protein (FP) EosFPを骨格として使用。Green 60 %, Red 40 %の割合で発現。Violet (UV) light (405 nm)でGreen→Redにfluorescent protein のexpressionが変化。active neuronのマーキングが可能。PFA fixationで蛍光が低下
- Ver.2 (Moeyaert et al., Nat. Commun., 2018, 応用例: Trojanowski et al., Neuron 2020): modest PC contrast, slow calcium unbiding, sensitivity to chemical fixatives as formaldehydeなどを改善。
- Reversible switchable (rs) (Sha et al., eLife 2020): 480 nm lightとactivityでmark (green fluorescent が低下)。405 nm UVで再度greenが発現。
- Ca2+ and light-gated switch system
- Cal-Light (Lee et al., Nat. Biotechnol., 2017)
iTango (Lee et al., Nat. Methods, 2017) とともに、blue-light-inducible TEV protease (BLITz) systemを用いたin vitro screening系で作製（TEV: tobacco etch virus）。TEV protease cleavage siteとAsLOV2 domainのoptimizationを行っている (Lee et al., Nat. Methods, 2017)。BLITz-1（Alanineが挿入されている）を選択。Tetracycline response element (TRE)でreporter geneの発現をコントロール。 - FLARE (Fast Light- and Activity-Regulated Expression; Wang et al., Nat. Biotechnol., 2017)
FLAREについては、TEV proteaseをそのままM13側に結合している。Original LOV2 domain (G528A/N538E mutant)にmutationを入れてoptimize、eLOVとして開発。NRX-TM（AAV packagingのため短くした）の後にNav1.6を挿入してsoma-targetingにしている。 - scFLARE Sanchez et al., P.N.A.S., 2020 single component型のFLARE
- Updated ver.としてFLiCRE (Fast Light and Calcium-Regulated Expression; Kim et al., Cell 2020)
TEV proteaseのoptimizeでultra TEVp (TEV-S153N mutant)を作製（Sanchez and Ting, Nat. Methods, 2019）。hLOV1の開発も。 - FLAREのupdateのほかにneuromodulate用のSPARKを作製
Editorial Notes:
- いちリスナーの自分がまさかゲスト出演することになるとは思っていませんでした。お二人との議論とっても楽しかったです！色々とbackgroundの前置きが長くなってしまいましたが、これから海外でポスドクしようとしている大学院生やポスドクの方に、こんな人もいるんだなぁ、と思って頂けるといいなと思います。またメインプロジェクトの論文出たら、ぜひ呼んでください！（長濱）
- 最初期遺伝子では神経活動を捉えられない、という見方と、遺伝子発現変化に繋がらない神経活動はエングラムではない、という立場があるのかな…何がノイズで何がシグナルなのか、とかの検証が色々できそう（宮脇）
- 出だしの導入で記録と操作が…とか言って始めていますが、「おい、(形態)観察は？」というツッコミが解剖寄りの人から来るのは想定済みです汗 (萩原)
